摘 要：目的：探讨癫痫持续状态模型中海马神经元损伤和可能机制。方法：购买山东大学实验动物中心提供的12只健康雄性Wistar大鼠，随机分为实验组、对照组，每组6只，统计分析两组大鼠的海马形态学变化、神经元凋亡情况、Glu R2蛋白表达、Glu R2/GAPDH耦合现象。结果：实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；持续6 h、1 d、3 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d的海马CA1、CA3区凋亡细胞数均多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；持续6 h、1 d、7 d、3 d的海马CA1、CA3区凋亡细胞数均逐渐增多，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠持续1 d、7 d的海马Glu R2蛋白表达均多于持续3 d，差异有统计学意义(P<0.05)，持续1 d、3 d、7 d的海马Glu R2蛋白表达均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠持续3 d的海马Glu R2/GAPDH蛋白复合物耦合程度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：癫痫持续状态会损伤海马神经元，可能机制为Glu R2表达下降、Glu R2/GAPDH蛋白复合物耦合增加。
关键词：癫痫持续状态;模型;海马神经元损伤;形态学变化;神经元凋亡;
癫痫持续状态被氯化锂-毛果芸香碱诱发后会引发几个脑区神经元的严重病变，其中最为显著的为海马区损伤[1]。本研究探讨癫痫持续状态模型中海马神经元损伤情况和可能机制，现报告如下。
资料与方法
购买山东大学实验动物中心提供的12只健康雄性Wistar大鼠，体重200～240 g，饲养温度23～25℃，让其自由饮食、进水。
方法：(1)试剂与仪器：购买美国Sigma-Aldrich公司生产的氯化锂，瑞士Roche公司生产的In Situ Cell Death Detection Kit(POD)原位凋亡检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司生产的二氨基联苯胺(DAB)，上海博生物试剂公司生产的蛋白酶抑制剂混合物，美国Santa Cruz公司生产的Normal rabbit Ig G+Protein A/G plus agarose。(2)动物分组与大鼠模型制备：随机分为实验组、对照组，每组6只。实验组对癫痫发作进行诱导途径为给予Wistar大鼠腹腔注射氯化锂127mg/kg,18～24h后给予其腹腔注射毛果芸香碱30mg/kg，注射毛果芸香碱前30 min给予大鼠腹腔注射硫酸安托品1 mg/kg，出现癫痫持续状态后1～1.5 h给予大鼠腹腔注射地西泮10 mg/kg将抽搐解除。依据Racine分级标准评价痫性发作行为学，正常行为状态评定为0级；面部肌肉在立须、眨眼、咀嚼等情况下抽搐，颤动呈“湿狗样”评定为1级；颈部肌肉抽搐，主要表现为点头运动评定为2级；前肢抽搐、阵挛评定为3级；双侧前肢伸直伴身体立起评定为4级；跌倒并全身惊厥评定为5级[2]。复杂部分发作：1级+2级+3级；全身强直阵挛发作：4级+5级，指成功诱发。对照组：给予Wistar大鼠腹腔注射等剂量氯化锂+生理盐水。(3)灌注取材：分批处死两组大鼠，然后用水合氯醛100 mg/L对大鼠进行麻醉后进行心脏灌流、固定、脱水、透明、石蜡包埋，用石蜡切片机连续冠状切片，厚度为5μm。对海马CA1、CA3区形态学变化、凋亡情况进行观察，途径为TUNEL染色、Nissl染色。
观察指标：(1)海马形态学变化。(2)海马神经元凋亡情况。(3)不同时间点Glu R2蛋白表达。
研究方法：(1)观察海马形态学变化。石蜡切片，常规脱蜡至水，孵育10 min，位置为在37℃水浴箱中，然后分化到背景无色，在此过程中分别将乙醇950 m L/L、硫堇5 m L/L充分利用起来，常规脱水、透明、封片。将1个切片从每隔5张中取出来，共将3张取出来Nissl染色。在显微镜(×400)下对CA1、CA3区100μm×100μm区域神经元数量进行计数[3]。(2)海马神经元凋亡情况。TUNEL染色，应用原位凋亡检测试剂盒，石蜡切片，常规脱蜡至水，将内源性过氧化物酶浸洗去除，在此过程中将过氧化氢(H2O2)30 m L/L充分利用起来。室温湿盒中对其进行通透，在此过程中将蛋白酶K充分利用起来。在37℃的温度下对TUNEL 1号、2号混合液进行反应1 h，用PBS代替1号液作为阴性对照组。PBS清洗后将TUNEL 3号液50μL加入，孵育30 min，位置为在37℃湿盒中。PBS清洗后将DAB加入显色，复染过程中将苏木精充分利用起来。常规脱水、透明、中性树胶封片。将邻近Nissl染色的脑片利用起来，阳性细胞指有棕黄色颗粒出现在胞核中。光镜下对染色结果进行分析，每组将阳性细胞最明显的3个×400高倍视野从CA1、CA3区选取出来，将每个高倍视野下的阳性细胞数计算出来[4]。(3)不同时间点Glu R2蛋白表达。Western blot测定，冰上以较快的速度将海马取出来，用上海碧云天生物技术有限公司生产的RIPA细胞组织快速裂解液将总蛋白提取出来，对蛋白浓度进行测定。每组用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺对蛋白20μg左右进行凝胶电泳，向聚偏二氟乙烯膜转入，TBST室温下封闭脱脂奶粉(50 g/L)70 min，将北京中杉金桥生物技术有限公司生产的1∶500小鼠β-action抗体、美国Chemicon公司生产的1∶800兔Glu R2抗体加入，室温下孵育30 min，在4℃的温度下过夜，室温下孵育辣根过氧化物酶耦联第二抗体70 min。采用美国LI-COR公司生产的C-Di Git化学发光扫描仪显影，运用电化学发光法对灰度值进行测定。将内参设定为β-action，蛋白相对表达量=目的蛋白/内参蛋白灰度值[5]。(4)癫痫持续3 d后Glu R2/GAPDH耦合现象。免疫共沉淀、Western blot技术检测，冰上以较快的速度将海马取出来，100∶1混合蛋白酶抑制剂混合物和Western blot及免疫沉淀细胞裂解液蛋白进行裂解，对蛋白浓度进行测定时运用BCA法。采用Normal rabbit Ig G+Protein A/G plus agarose将非特异结合蛋白去除。在Normal rabbit Ig G、兔Glu R2抗体中分别加入蛋白500～600μg，在4℃的温度下孵育过夜。在4℃的温度下孵育Protein A/G plus agarose 1 h，离心30 s，速率为10 000 r/min，将上清弃去。将1×SDS上样缓冲液30μL加入沉淀中，煮沸变性，进行Western blot步骤，比较实验组和对照组中GAPDH和Glu R2灰度值，将GAPDH/Glu R2的耦合变化获取过来[6]。
统计学分析：使用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料用表示，比较采用F检验，重复测量的计量资料进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
两组大鼠的海马形态学变化比较：实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，持续6 h、1 d、3 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数均逐渐减少(P<0.05)，但持续6 h和7 d的海马CA1、CA3区神经元细胞数之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 两组大鼠的海马CA1、CA3区神经元细胞数比较
两组大鼠的海马神经元凋亡情况比较：实验组大鼠持续6 h、1 d、3 d、7 d的海马CA1、CA3区凋亡细胞数均多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，持续6 h、1 d、7 d、3 d的海马CA1、CA3区凋亡细胞数均逐渐增多(P<0.05)，但持续1 d和7 d的海马CA1、CA3区凋亡细胞数之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 两组大鼠的海马CA1、CA3区凋亡细胞数比较
两组大鼠的海马Glu R2蛋白表达比较：实验组大鼠持续1 d、7 d的海马Glu R2蛋白表达均多于持续3 d，差异有统计学意义(P<0.05)，持续1 h、6 h的海马Glu R2蛋白表达和对照组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)，持续1 d、3 d、7 d的海马Glu R2蛋白表达均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。
图1 不同时间点Glu R2蛋白表达
两组大鼠的癫痫持续3 d后海马Glu R2/GAPDH耦合现象比较：实验组大鼠持续3 d的海马Glu R2/GAPDH蛋白复合物耦合程度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
图2 大鼠海马裂解液中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶
讨论
本研究结果和相关医学研究结果一致[7,8]，说明癫痫持续状态大鼠模型中的神经元损伤为谷氨酸具有较多的释放，通过Glu R2/GAPDH耦合在AMPAR上作用，进而引发兴奋性神经毒性，可能和脑缺血模型中的神经元变化类似。
综上所述，癫痫持续状态会损伤海马神经元，可能机制为Glu R2表达下降、Glu R2/GAPDH蛋白复合物耦合增加。
参考文献
[1]陈玲萌孟祥玥.张艳,等.癫痫持续状态后小鼠海马组织神经元中微管蛋白和内体溶酶体系统表达的变化及其意义[J.吉林大学学报(医学版),2020.46(3):470-475.后
插3-后插4.
[2]蔡栋梁，赵塔娜加巴喷丁对癫痫大鼠海马神经元及P75NTR表达的影响[J]深圳中西医结合杂志,2020,30(3)-:1-3.
[3]朱建坡梁冰右美托咪定调节MAPK/ERK-CREB通路对大鼠海马神经元凋亡的保护作用[J]中风与神经疾病杂志,2020,37(4):317-321.
[4]陈秋，何会，青绍华,等大鼠癫痫持续状态对海马神经元的损害及腺苷A2A受体阻断剂的保护作用研究[J]临床和实验医学杂志.2019,18(23):2490-2493.
[5]吴琼,袁裕钧,王华大麻素2型受体对癫痫持续状态大鼠海马CA1区自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达的影响[J] 中国小儿急救医学,2019,26(7):486-491.
[6]谭东宇,王静宇,高悦等天然冰片对癫痫持续状态小鼠海马组织TRPV1、TRPA1及 GABA表达的影响[J]中华中医药杂志,2019 ,34(11):5090-5094.
[7]燈斌,郭振元，闫波,等依达拉奉对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase-3表达的影 响[J]中外医疗,2019,38(3):23-25.
[8]王军,李承宗,龙浩,等颞叶癫痫动物模型研究进展([J].中国神经精神疾病杂志,2019,45(1):60-64.
