摘 要：文章介绍弥漫大B细胞淋巴瘤目前的治疗方法和病理生理学特点，特别是核转录因子-κB复合物及其靶基因Gadd45β如何在抑制JNK介导的凋亡通路中发挥作用，这与目前对DTP3的研究有关。DTP3是一种新型的Gadd45β靶向药物，其对多发性骨髓瘤具有显著的疗效和特殊的安全性。
关键词：DTP3; 弥漫大B细胞淋巴瘤;非霍奇金淋巴瘤;
弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)
DLBCL是一种常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占NHL的24%[1]。与其他类型的B细胞淋巴瘤相比，DLBCL具有高侵袭性，表现为疾病的快速进展。只有50%的患者通过使用包括利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松等混合药物的标准治疗获得完全缓解，而另外50%的患者预后普遍较差[2]。DLBCL可进一步分为活化B细胞(ABC)样亚型、生发中心B细胞(GCB)样亚型和基于来源细胞未分类的亚型[3]。已知有许多致癌基因与这些疾病相关，如c-myc、bcl-2、bcl-6、EZH2、MYD88、CREBBP、CD79A和CD79B，以及PAX5[2]。
构成型IκB磷酸化激酶β(IKKβ)/核因子-κB(NF-κB)激活在DLBCL中的作用
NF-κB通路的抗凋亡作用于1995年首次在肝脏中发现，Rel A敲除小鼠在胚胎形成过程中表现出大规模的肝细胞凋亡[4]，所以其在免疫系统中的主要作用，特别是在B细胞生存和成熟中的必要性也被发现[5]。活化的NF-κB复合物由Rel A和p50组成，是一种转录因子，通过抵抗自然凋亡来调节基因，这些基因是正常细胞存活的关键，其激活了许多抵抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)信号引起的细胞凋亡基因表达，包括c IAP、c IAP2、XIAP、TRAF1、TRAF2、c-FLIP和bcl-2成员[6]。此外，还具有直接和间接抑制JNK通路的作用，通过上调生长抑制和DNA损伤诱导的Gadd45β蛋白来抑制JNK通路介导。丝裂酶原活性蛋白激酶7(MKK7)拮抗剂Gadd45β可以阻止JNK的磷酸化，从而激活JNK[7]。NF-κB通路的构成型激活与DLBLC的ABC样亚型的生存和恶性肿瘤有关，在ABC细胞系中观察到IκBα蛋白体降解、IκB激酶活性与DNA结合具有高发生率。有研究表明，抑制NF-κB通路可导致ABC-DLBLC细胞系中癌细胞死亡和在G1处生长阻滞[8]。此外，在浆细胞癌、多发性骨髓瘤中也观察到通过上调Gadd45β蛋白表达的特异性JNK抑制[9]。
DLBCL目前的治疗方案
淋巴瘤的标准治疗方法(R-CHOP方案)对于新诊断病例的一线治疗，可根据肿瘤大小和分期进行化疗。有学者采用利妥昔单抗替代奥布妥珠单抗和添加剂量调整的依托泊苷，同时改变剂量和间隔时间，以改善标准R-CHOP方案，但治疗效果不显著[10,11]。基于细胞的起源，ABC亚型被发现在很大程度上是由B细胞受体(BCR)信号通路，然后导致NF-κB通路失调，可能导致失控的细胞增殖和高抵抗细胞凋亡、自噬和坏死[12,13]。基于这一观察，有学者在标准R-CHOP方案中添加了一种旨在抑制蛋白体降解的激活Rel A和p50复合物，以特异性靶向BCR和NF-κB通路，然而伊布替尼和硼替佐米在Ⅱ期和Ⅲ期阶段均无显著效果[14]。这表明需要一种新的治疗药物，专门靶向NF-κB通路治疗ABC样亚型，与GCB样亚型相比，预后较差。
对于复制性和难治性疾病，通常考虑挽救性化疗和自体干细胞移植(ASCT)。然而，使用ASCT治疗的R/R DLCBL的效果较差，只有37%的患者成功达到了3年无进展生存时间(PFS)，而对于不符合移植条件的患者，则3年PFS甚至更低。
靶向NF-κB通路在癌症中的益处和局限性
由于NF-κB在免疫系统中发挥关键作用，在癌症中靶向NF-κB通路可能存在需要解决的显著缺陷。小鼠中IKKβ缺失导致的NF-κB抑制时间延长，由于白细胞介素-1β水平的升高，导致内毒素休克的发生率更高[15]。此外，NF-κB通路可以被绕过，尤其是在实体癌症中，在NF-κB中观察到生长抑制，而不是预期的细胞凋亡。此外，还有一些方法可以通过激活该通路的其他成分来覆盖抑制作用，例如，对IKKβ的抑制作用可以被IKKε所取代。另一方面，靶向NF-κB的好处已经在一些动物模型中得到了证实。在结直肠癌和肝细胞癌的小鼠模型中也观察到癌细胞凋亡和癌症进展停止的结果[13]。在血癌的情况下，多发性骨髓瘤中NF-κB抑制显示了对癌细胞的特异性杀伤，对正常细胞几乎无不良反应[9]。
Gadd45β靶向药物在癌症中的潜力
Gadd45β基因是NF-κB复合物的转录靶点，编码的蛋白占据MKK7的催化口袋并抑制，MKK7是负责磷酸化的关键激酶，从而激活JNK，最终导致细胞凋亡。这一机制发现被多发性骨髓瘤劫持，并开发了一种高效、低毒性的治疗药物DTP3，可特异性逆转Gadd45β对MKK7的抑制[9]。该药物证明了Gadd45β在其他类型癌症中靶向的潜力，许多对NF-κB途径上瘾的癌症之一是DLBCL，这可能也存在Gadd45β抑制。此外，Gadd45β复合物也在许多实体癌中被发现，包括肝细胞癌和结肠直肠癌。
理由和目的
NF-κB在DLBCL孤雌生殖中的作用已经在许多研究中得到证实，特别是对于更具侵袭性的ABC亚型。尽管目前使用R-CHOP方案治疗对50%的患者具有显著治疗效果，但另外50%患者需要一种新的高效和安全的治疗方法。Gadd45β是通过NF-κB复合物抑制JNK凋亡通路的上调基因产物之一。Gadd45β合成一种名为DT3的三肽，旨在变构逆转对MKK7的抑制，MKK7是激活JNK的关键激酶。DTP3对多发性骨髓瘤患者细胞表现出良好的治疗效果，且对其他组织细胞的毒性较小[9]。这一结果使学者们认为是否可以在DLBCL患者细胞中产生类似的结果，从而更多地阐明其潜在机制和其他类型NHL的开放可能性。
基于上述简短的推理，进行以下假设：(1)Gadd45β在ABC-DLBCL孤雌生殖中具有重要作用：为了研究Gadd45β在ABC-DLBCL肿瘤发生中的作用，制备Gadd45β野生型和Gadd45β敲除(KO)小鼠模型。这两种小鼠模型都具有高的构成性NF-κB激活来驱动B细胞的增殖和分化。在GC-B细胞中，通过缺失Blimp1(Blimp1F/F)和cre介导去除IKK2上游的STOP序列来实现NF-κB通路的靶向特异性激活。如果没有Blimp1,GC-B细胞将分化为浆母细胞，并在该阶段被抑制。通过绿色荧光蛋白(e GFP)可以观察到肿瘤在各种组织中的存在。采用免疫组化、免疫组荧光和荧光激活细胞分选(FACS)监测增殖率、凋亡和致癌细胞通路的激活，如NF-κB、bcl-2、Myc等。还使用超声对小鼠进行临床监测，特别是强调肿瘤生长和转移的存在。(2)DTP3可发展为一种安全有效的治疗DLBCL患者的方法：通过动物模型评估DTP3的靶效应(疗效)程度以及脱靶效应(不良反应)程度。将小鼠注射悬浮于重组基底膜制备的DLBCL细胞和磷酸盐缓冲盐(PBS)，将在免疫抑制NOD/SCID小鼠中建立异种移植DLBCL小鼠模型。这些小鼠会出现两种情况，一为由于FOXN1突变而缺乏功能性胸腺，二为由于Prkdc突变而导致V(D)J重排受损。根据肿瘤体积、大小和直径进行判断，小鼠将注射不同浓度的DTP3(DTP3组)或生理盐水(对照组)。然后在不同时间点处死小鼠，测量肿瘤体积和JNK激活的细胞凋亡存在。将DTP3组与对照组进行比较，以研究DTP3是否停止DLBCL的进展。如果观察到阳性结果，将进行TUNEL检测凋亡细胞，免疫印迹检测存在磷酸化的JNK、活化半胱天冬-3(裂解)、灭活半胱天冬-3(未裂解)和PARP-1、半胱天冬-3的蛋白水解底物。以期望证明DTP3介导的Gadd45β抑制导致JNK激活，最终使肿瘤细胞凋亡。DTP3在小鼠模型中的安全性研究显示，对照组和DTP3组之间的任何行为变化或明显痛苦迹象进行比较，信号可以来自眼睛、鼻、脸颊、胡须和耳朵等部位，来自其他组织或其他类型的免疫或造血细胞的细胞也将使用具有特定生物标记物的微珠从小鼠中分离。将使用上述相同方法检测意外的细胞凋亡或JNK激活，以检测DTP3的任何脱靶效应。(3)DTP3在DLBCL细胞系中靶向MKK7：此为确认DTP3与MKK7的相互作用，从而确认DTP3的治疗机制。由于DTP3和MKK7的相互作用已经在多发性骨髓瘤细胞系中得到证实[9]，目的为观察是否可以在DLBCL细胞系中复制。选择Gadd45β高表达水平的DLBCL细胞系，通过RT-PCR证实这一点。DTP3和MKK7的相互作用将通过使用琼脂糖快速流动树脂的肽下拉实验来证实。一旦确认，细胞系将用DT3处理，并使用台盼蓝进行细胞活力试验，以确认DT3/MKK7相互作用与DLBCL生长抑制之间的相关性。(4)DTP3逆转Gadd45β对MKK7的抑制并恢复其激酶活性：最后，确认DTP3是否逆转了Gadd45β对MKK7的抑制作用。进行激酶活性，免疫沉淀的MKK7和Gadd45β将在细菌表达的纯化JNK和标记ATP的溶液中，首先测量不添加DTP3的MKK7活性，然后在添加DTP3后确认MKK7的激酶活性是否按预期进行逆转。
结语
综上所述，50%的DCBLC患者对标准的R-CHOP治疗方案反应良好，复发或难治性病例的预后一般较差。目前R-CHOP替代方案无显著效果，且有不良反应。DTP3在多发性骨髓瘤中显示了进一步研究的可能性。如果DLBCL中的DTP3产生与多发性骨髓瘤相似的结果，那么可以相对安全地假设相同的结果可以在劫持Gadd45β/MKK7复合物的其他类型癌症中复制。在淋巴瘤、肝细胞癌、垂体促性腺激素肿瘤和结直肠癌中也发现了Gadd45β的不调控表达。此外，如上所述，以癌症类型特异性的方式靶向NF-κB通路一直很困难，如果DTP3抑制DCBLC的生长，则可以作为DCBLC的选择性NF-κB抑制剂。这可能说明特定的NF-κB抑制剂只能通过途径本身的成分实现，也可以通过特定的下游效应因子，如Gadd45β实现。
