探讨磁珠法与煮沸法对乙型肝炎病毒基因分型检出率及其与HBV DNA定量的关系
摘 要：目的：研究磁珠法与煮沸法用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因分型的检出率，并探讨基因分型检出情况与HBV DNA定量间的关系。方法：2019年6月-2019年9月收治乙肝患者95例，随机分为两组，A组应用磁珠法，B组应用煮沸法对血浆进行处理，提取HBV DNA后通过实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行肝炎基因分型及DNA定量。比较两组患者检测结果并探讨基因分型结果检出率与HBV DNA定量水平的关联。结果：A组患者B型、D型、B/C混合型及总检出率均显著高于B组，C型检出率显著低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；两种方法检测HBV基因型检出率与HBV DNA水平呈正比，但应用磁珠法对低DNA水平样本的基因型检出明显优于煮沸法。结论：磁珠法提取核酸阳性率与灵敏度均较高，对于非C型及低病毒载量患者具有较高检出率。
关键词：磁珠法 煮沸法 乙型肝炎病毒 基因分型 HBV DNA定量
乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致乙型肝炎与肝癌死亡的最主要原因之一。相关研究指出，目前全球约有超过20亿人感染过HBV，约有超过3.5亿人为慢性HBV感染者。既往临床多通过血清学方法对HBV进行检测，但检出率相对较低，无法准确地对HBV早期感染情况进行反映，近年来随着临床对疾病研究的不断深入，临床人员逐渐发现基因分型与乙肝标志物的表达、疾病的发生与进展及肝硬化、肝癌的发生风险、治疗效果及预后均存在密切关联[1-2]。选择一种快速、简便的基因检测方法对临床用药指导及评估预后具有重要意义。聚合酶联反应PCR可以快速、灵敏、特异性地检测HBV DNA，尤其是实时荧光定量PCR可定量检测HBV DNA，在乙肝的临床诊断、治疗监测及预后评估方面起着重要作用，而在PCR测定准确性方面，标本HBV DNA的提取效率是重要因素。本文将95例患者分为两组分别应用磁珠法与煮沸法提取血浆并对HBV进行分型，同时探讨分型与HBV DNA的关系，现报告如下。
资料与方法
2019年6月-2019年9月收治乙肝患者95例，男53例，女42例；年龄41～65岁，平均(53.2±12.0)岁。纳入标准：(1)诊断均符合2015年修订的《慢性乙型肝炎临床诊断标准》；(2)血标本无溶血、无脂血，抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV及抗-HIV均为阴性。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾功能不全患者；(2)酒精性肝病、代谢性肝病及其他病毒感染导致的肝病；(3)精神疾病及意识障碍无法积极配合治疗患者。所有参与本次研究患者均在知晓本次研究目的的前提下自愿签署知情同意书，且本次研究经我院伦理委员会审核并批准。随机分为两组。A组48例，男25例，女23例；年龄41～65岁，平均(53.2±12.0)岁。B组47例，男28例，女19例；年龄40～66岁，平均(53.1±12.1)岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
方法：抽取患者2～3 m L非抗凝血，保持转速为3 600 r/min，离心时间≥5 min，分离出血清后将血清放置于-20℃冰箱中待检。(1)A组患者应用磁珠法检测：根据试剂盒中说明书要求，取血清标本、标准品、质控品、阳性对照及阴性对照品各200μL后，添加已分装好的核酸提取液在孔板当中，根据设定的提取程序进行自动核酸提取并可获得100μL核酸洗脱液，之后采用实时荧光PCR进行基因分型及DNA定量。(2)B组应用煮沸法：根据试剂盒说明书要求进行：提取标本、标准品、质控品、阳性对照及阴性对照品各100μL，先后加入样本处理液及核酸提取液进行处理。100℃孵育10 min并保持12 000 r/min离心10 min，取上清液DNA采用实时荧光PCR进行基因分型及DNA定量。PCR扩增反应条件及结果判断：于93℃对反应管进行保温2 min，先按93℃45 s,55℃60 s循环10次；再按93℃30 s,55℃45 s，循环30次；在第2次循环55℃45 s时完成荧光检测。反应结束后，可将拷贝数根据同时扩增的标准品进行自动读取。以临界值1.00×102IU/m L为界线作为结果判断，超过1.00×102IU/m L记为阳性，未述到指标则记为阴性。
观察指标：比较两种方法检测HBV基因分型结果，并探讨基因检出率与HBV DNA定量的关系。
统计学处理：数据应用SPSS 20.0软件处理；HBV DNA载量经对数转换后以(±s)表示，应用t检验进行比较；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。
结果
不同方法HBV基因分型结果比较：A组患者B型、B/C、D型混合型及总检出率显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05);A组患者C型检出率显著低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 不同方法HBV基因分型结果比较[n(%)]
不同方法基因分型检出率与HBV DNA定量关系：将A、B两组患者的HBV DNA定量水平与基因型别进行罗列后对比。从总检出率来说，两种方法均表明HBV基因型检出率与HBV DNA定量水平呈正比，但A组对于低DNA水平的样本基因型的检出明显优于B组。见表2。
表2 不同方法基因分型检出率与HBV DNA定量关系[n(%)]
讨论
近年来，随着基因检测技术的不断进步与发展，分子生物学在各类疾病的诊断、治疗及评估预后中发挥着重要作用。血液中HBV DNA载量不仅能反映HBV复制程度与传染性，也能反映抗病毒药物疗效与预后[3]。HBV基因检测方法根据不同HBV基因型的差异序列设计一系列特异性引物，应用基因型特异性引物PCR法进行检测。PCR扩增后可获得程度不同的片段并在此基础上进行分型。这一过程中，关键步骤是HBV DNA的提取，检测基因分型中起重要决定性的步骤为如何成功提取HBV DNA。既往临床应用煮沸法对血液中HBV DNA进行提取，通过高温煮沸后从病毒颗粒中释放病毒DNA后，经离心沉淀后DNA可存在上清液中。磁珠法通过裂解细胞充分帮助游离DNA特异性吸附在磁珠颗粒表面，蛋白质等其他杂质则留在溶液中，磁性颗粒可在磁场作用下与液体分开并经过洗脱后得到病毒DNA[4-5]。本研究发现，应用磁珠法提取HBV阳性率在B型、D型当中的阳性率显著高于煮沸法，而且低病毒载量也能检测出基因型别，显著提升了基因分型检出率。这可能是由于煮沸法在高温时可导致血浆蛋白凝固部分核酸被包裹，离心沉淀时发生丢失而减少上清液中核酸量，同时，煮沸法对血清标本仅是从病毒颗粒中将病毒DNA释放出来，离心后的上清液不仅有DNA，其他一系列影响PCR反应的杂质如血红蛋白等也可能存在；而磁珠法通过磁性将DNA吸出可较好地将血清中杂质进行去除，对PCR反应干扰较小，以促进达到较好的检出率[6]。同时，磁珠高效率的吸附核酸，跳过了煮沸法浓缩提取中核酸沉淀步骤；磁珠与DNA同时保留，进一步减少了DNA丢失，达到核酸富集的目的。
综上所述，磁珠法对HBV DNA并结合荧光PCR对检测HBV基因分型具有较高检出率，对HBV的检测灵敏度明显高于煮沸法，是一种更为理想的核酸提取方法，其应用更可在慢乙肝患者抗病毒治疗方案选择、隐匿性HBV感染筛查、术前HBV检查等方面提供重要的临床价值。
参考文献
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