鼻窦炎模型兔的Notch信号通路功能的动态变化

时间:2021-10-14 所属分类 论文指导 作者有话说:期刊信息纠错
摘    要:目的:通过构建体内外骨质重塑模型,探讨Notch信号通路与miRNA-155的相互作用,明确其在难治性鼻窦炎骨质重塑中的作用及机制。方法:选取兔鼻窦炎模型鼻窦骨质,检测Notch的表达及与骨质重塑相关细胞因子的关系。检查制备兔鼻窦炎模型,采用CT扫描及病理切片进行骨质重塑的评分。HE、碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色,从组织学水平对标本骨质的炎症程度进行评估,探讨不同时间兔鼻窦炎症变化程度,通过CT值评估骨质重塑的程度。结果:Notch基因在慢性鼻窦炎小鼠鼻中隔黏膜中高表达,说明Notch基因在慢性鼻窦炎的炎症过程中发挥一定作用。结论:Notch信号传导通路在鼻窦炎模型兔疾病的发生发展中,具有重要的调控作用。
关键词:鼻窦炎 模型兔 Notch 信号通路

慢性鼻窦炎(CRS)是发生于鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病。欧洲的一项多中心研究显示CRS的患病率为6.9%~27.1%,中国CRS的发病率为2.2%~8%,且常合并哮喘及慢性阻塞性肺疾病等下呼吸道疾病,已成为严重的公共健康问题[1]。Notch受体于1917年在果蝇中被发现,于1983年被首次克隆并命名[2]。Notch基因在慢性鼻窦炎小鼠鼻中隔黏膜中高表达,说明Notch基因在慢性鼻窦炎的炎症过程中发挥一定作用[3]。因此,本项目通过体外培养破骨细胞,并观察与骨质重塑密切相关的多种蛋白和细胞因子与Notch信号通路的关系,用mi RNA-155阻断细胞Notch信号通路的传导,观察蛋白及细胞因子表达的变化。

资料与方法

分离、培养兔大腿骨骨髓破骨细胞,比较细菌脂多糖(LPS)刺激前后不同时相Notch受体表达与多种蛋白和细胞因子的关系。(1)选用新西兰白兔,断颈处死,无菌条件下分离完整股骨、胫骨,暴露髓腔后用α-MEM培养基(含10%胎牛血清)冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止。接种于10 cm培养皿,标准培养(饱和湿度、5%CO2、37℃)12 h后收集非贴壁细胞,1 500 r/min,37℃离心5 min,弃上清,视为破骨前体细胞,加入M-CSF(20 ng/m L)和RANKL(30 ng/m L)诱导其向破骨细胞分化。HE、碱性磷酸酶和TRAP染色,光镜下观察破骨细胞形态。(2)利用RT-PCR、Westernblotting与流式细胞术在m RNA与蛋白水平检测Notch受体在破骨细胞的表达。试验组分别加入含不同浓度的LPS的培养液,对照组只加入含5%胎牛血清(FBS)的培养液,形态学观察及四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)细胞计数。观察Notch蛋白表达量的变化。评估这些变化与破骨细胞数量变化的关系。(3)另选几组在加入含LPS的培养液同时,用mi RNA-155阻断细胞Notch信号通路的传导,观察蛋白及细胞因子表达变化和破骨细胞数量变化。
制备兔鼻窦炎模型,并评估骨质重塑的程度:(1)选择新西兰白兔进行CT检查,并建立排除鼻和鼻窦疾病的模型。该细菌获自国际标准金黄色葡萄球菌菌株,并用作1麦当劳单位(108CFU/m L)在正常生理盐水中的悬浮液。称重动物并通过耳静脉注射用2.5%戊巴比妥钠0.8 m L/kg麻醉。在鼻子后面的中线右侧做一个1~1.5 cm的纵向切口,将皮下组织与骨膜分开。在上颌窦的前壁开一个直径为3 mm的孔,取适量的无菌棉球并使用内镜。在直视下,上颌窦并没有完全被上颌窦的内侧所阻塞。使用1 m L注射器,将0.3 m L细菌悬浮液吸入鼻窦和上颌窦的绒毛,然后逐层缝合骨膜,皮下组织和皮肤,并使用酒精,消毒伤口。(2)到达实验周后,进行CT扫描以测量每个显示上颌窦骨壁的CT图像中最厚骨骼的CT值,并获得最大值、最小值和平均值。收集CT数据后,笔者记录了该动物死于5种过量的钠过量。保留鼻颌窦组织的样本。将样品在10%中性甲醛中固定3 d,用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙2个月,包埋在常规石蜡中,制备连续切片并用HE染色。每只动物随机选择5片上颌窦和上颌窦壁,并在光学显微镜下观察、评估上颌窦和上颌窦壁的骨质量。
选取兔鼻窦炎模型鼻窦骨质,检测Notch受体的表达,及其与骨质重塑相关多种蛋白和细胞因子的关系。选取兔鼻窦炎模型鼻道窦口复合体骨质,利用RT-PCR、Westernblotting与流式细胞术检测Notch受体的表达。观察细胞因子与Notch蛋白的关系,以及与骨质重塑程度的关系。
mi RNA-155抑制Notch信号通路对兔鼻窦炎模型骨质重塑的影响。兔鼻窦炎模型腹腔注射mi R-155抑制Notch信号通路,采用CT扫描及病理切片进行骨质重塑的评分。HE、碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色,从CT值及组织学水平评估标本骨质炎症程度的变化,选取兔鼻窦炎模型鼻窦骨质,检测Notch受体的表达,进而探讨mi RNA-155与Notch信号通路的交互作用。

结果

Notch基因在慢性鼻窦炎小鼠鼻中隔黏膜中高表达,说明Notch基因在慢性鼻窦炎的炎症过程中发挥着一定的作用。详见图1。

图1 小鼠鼻中隔黏膜Notch1-4m RNA的表达量比较

讨论

因为Notch受体及其配体包含跨膜区域,所以Notch信号传导途径在相邻细胞之间传递信息。当配体与相邻细胞中的受体结合时,只有金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子转换酶(TACE)被激活,Notch受体的大多数胞外域(NECD)被TACE阻断,内部结构被阻止、触发。结构域(NICD)中的构象变化使其更容易受到γ-分泌酶的作用,并且NICD在第二次切割后释放。NICD以两种方式转运到细胞核,从而激活下游靶基因。即c-蛋白结合因子1(CBF1)依赖性途径(也称为经典途径)和CBF1非依赖性途径(也称为非经典途径)。CBF1在与NICD结合之前是一个转录阻遏物,可能会抑制Notch靶基因的转录。当NICD进入细胞核时,它与CBF1和转录激活蛋白家族MAML结合,将CBF1从转录阻遏物转化为激活物,形成促进Notch靶基因转录的三元复合物。最著名的缺口靶基因是编码基本螺旋-环-螺旋(b HLH)家族的转录因子的基因。这些转录因子可以进一步调节下游分子的表达。到目前为止,关于非经典途径的研究很少,并且尚不清楚细胞如何在这两种途径之间进行选择。此外,研究表明,Notch信号通路本身具有负反馈调节机制。该机制对于维持Notch信号通路中适当的活性水平和维持细胞稳态的调节至关重要。
研究表明,Notch信号通路在鼻窦炎的炎症过程中起重要作用,不仅影响B和T淋巴细胞的发育和免疫反应,而且影响骨骼重塑的调节。Notch信号传导可通过降低OPG表达水平以非细胞自主方式调节破骨细胞的形成。体外实验还表明,Notch1和Notch2信号可以自主调节骨疾病细胞的分化过程。抑制骨病前体的Notch 1信号以促进分化为骨病细胞。用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号或用sh RNA干扰阻断Notch 2信号可以阻断由核因子-k B受体激活剂配体诱导的骨病性细胞分化过程。Notch 2信号的激活可能会促进NF-k B。受体活化剂配体诱导的骨分裂和分化过程。因此,在骨疾病的分化过程中,调节切口信号的过程涉及两种细胞方法(自主或非自主)。由于骨病性前体细胞主要表达Notch 2受体,因此表明Notch信号传导的联合作用可能是骨病性细胞分化的积极调节剂。

参考文献
[1]Heng Z,Min T,Pin-Fang K,et al.Effects of irbesartan on Notch1 signaling pathway in diabetic rats with myocardial injury[J].Chinese Journal of Applied Physiology,2018,34(5):427-431.
[2]Hsiao CD.Overexpression of Notch Signaling Induces Hyperosteogeny in Zebrafish[J].International Journal of Molecular ences,2019,20(15):3613.
[3]Wu TY,Hu HH,Chen C.Effects of ivabradine on Notch and NF-kappa B signaling pathway in myocardial cells of rats with myocardial infarction[J].海南医科大学学报:英文版,2019,25(11):9-13.
[4]蔡万翔,江蓉星,王敏,等.活血通络汤在家兔激素性股骨头缺血性坏死模型中对Notch1、DLL3和HERP1的影响[J].中华中医药杂志,2018(1):300-303.
[5]胡敏利,应双伟,罗文达.mi R-92a-3p靶向调控NOTCH信号通路对T-ALL细胞增殖的影响机制[J/OL].重庆医学:1-6[2020-12-28].

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